作者：李鸿阳，辛强

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注：文中【】内数字系参考文献号

1. 背景

细菌内毒素检测（bacteria endotoxin testing，BET）是生物药生产的中间控制和批放行必须进行的测试之一，其经典的测试方法是兔子发热试验。美国FDA大约在40年前就允许制药公司采用著名的鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate-LAL）测试方法来替代动物发热实验进行内毒素的测试【1】。要进行LAL测试，就必须要有内毒素标准品。通常，内毒素标准品有两个来源，一种是官方的，即来自国际公认或国家法定的检验机构；另一种是由鲎试剂生产公司提供，经过与官方内毒素标准品比对的标准品。官方内毒素标准品被称为基准标准品（primary standard），例如美国USP所提供的内毒素标准品， 而鲎试剂生产公司所提供的标准品则被称为二级标准品（secondary standard）或者三级标准品 （tertiary standard）。那么问题就来了，如果申报一个美国FDA的生物药（BLA）, FDA是不是会要求企业一定要采用USP官方内毒素标准品呢?

2. 问题的解答

早在1977年，美国FDA 就描述了使用 LAL测试内毒素的条件，并于1983年正式表示可以用LAL测试进行终产品批放行的内毒素检测。接着1987年，美国FDA又颁布了验证鲎试剂测试终产品内毒素的工业指南 “Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices (the 1987 Guidance)”【1】。然而，美国FDA于2012年6月正式撤回了这个指南，理由是这个指南已经不能代表FDA当时的理念。FDA同时指出USP之85章和161章所提供的信息可以涵盖这个工业指南。取而代之的是一个FDA新的关于热源和内毒素测试的工业指南问答“Guidance for Industry Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers”【1】。这个问答式工业指南的第13问是这样的： “13. Are control standard endotoxins still acceptable for use in running BETs? ” 这其中Control standard endotoxins （CSE），可译为内毒素参照品，在USP XXI（USP, 1985）里有其定义【2】，即：

"A Control Standard Endotoxin (CSE) is an endotoxin preparation other than the RSE that has been standardized against the RSE. If a CSE is a preparation not already adequately characterized, its evaluation should include characterizing parameters both for endotoxin quality and performance (such as reaction in the rabbit) and for suitability of the material to serve as a reference (such as uniformity and stability)  内毒素参照品（CSE）不是内毒素标准品，而是与内毒素标准品标准化的内毒素制备品。如果一个CSE是没有被完善地表征的制备品，其评价应该包括内毒素质量和效能（如在兔子体内的反应）的表征以及其作为参照品（如均匀度和稳定性）的表征”。

因此， 据此定义，内毒素参照品（CSE）就是一个二级标准【2】。

FDA对该问题之回答是：“Control standard endotoxins (CSEs) are endotoxin preparations other than the international or national reference standards that are traceable in their calibration to the international reference endotoxins standard. CSEs may be secondary or tertiary standards and are usually manufactured and certified by an LAL reagent manufacturer for use with a specific lot of reagent under defined assay conditions. CSEs have become an accepted source for preparation of standard curve calibrators and as assay controls, and have provided a cost saving to LAL users and helped to preserve the inventory of primary standards. FDA encourages the continued use of CSEs that are suitably calibrated to the international reference endotoxins standard. CSEs是内毒素的制备品，尽管它们不是国际或国家级的标准品，但是其标定都是追溯至国际或国家级的内毒素标准品。CSEs可能是二级或三级标准品，通常是由LAL试剂厂商生产并被认证用于指定含量测试条件下的某个具体批次的试剂。CSEs已经成为一种被接受的制备标准曲线的标定物之来源，并可以作为含量测试的参照品。这些CSEs为LAL的使用者节约成本，并帮助保护基准标准品的存量。FDA鼓励继续采用通过国际内毒素标准品适当标定的CSEs“。

根据这个回答，我们可以做以下的解读。

    1）美国FDA允许制药企业在申报BLA时采用二级或者三级内毒素标准品

    2）这些标准品必须与国际或国家的官方基准标准品进行适当的标定。

    3）这些标准品可以是来自于LAL试剂生产商

    4）这些标准品的标定，也可以是由鲎试剂生产商完成

3. 结论

因此，我们可以得出结论，美国FDA允许制药公司在申报BLA时，采用LAL试剂公司所提供的二级或三级标准品进行终产品批放行的内毒素检测。所以，答案是：非必须。

4. 备注

本文仅适用于申报美国FDA生物药（BLA）的情况。

另据作者浅薄的知识了解，国内CDE对此问题尚没有明确的法规指导，期待国家局会出台相应的法规或指导原则。

5. 致谢

作者特别感谢Marion Michaelis女士和黄懿博士帮忙解答问题，并提供参考资料。

6. 参考文献

【1】美国FDA关于热源和内毒素测试问答的工业指南“Guidance for Industry Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers”

【2】K. McCullough etc. Endotoxins Standards and Their Role in Recovery Studies: The Path Forward, Bio. Pharma Asia, Nov/Dec. 2016