在隔离器汽化过氧化氢（Vapor Phase H₂O₂）净化工艺的开发和验证实践（CDCV）中，最大或然数（Most Probable Number, MPN）法被广泛地用于处理生物指示剂（Biological Indicator, BI）出现的“反常（rogue）”阳性结果。这一做法已被纳入包括PDA第51号技术报告在内的行业指南，在实际生产中获得了相当程度的应用。

MPN应用前提：不是在评价“灭菌”效果

汽化过氧化氢工艺在隔离器中的应用，在制药行业的技术文献中常被不严谨地称为“灭菌（sterilization）”，然而从严格的无菌保证工程学定义来看，这一工艺的工程能力、验证标准和实际应用场景更准确地应被归类为“净化（decontamination）”。灭菌要求对产品内部及表面达到无菌保证水平（SAL）≤ 10⁻⁶，即产品中存活微生物的概率不超过百万分之一。若初始生物负载为10⁶个孢子，要达到SAL 10⁻⁶，需要实现12个对数的微生物削减（从10⁶降至10⁻⁶，跨越12个数量级）。这一要求依赖于明确的物理致死量参数和可重复的稳态条件，适用于最终灭菌产品的直接灭菌。而净化则面向非最终灭菌产品生产环境中的设备表面、洁净室墙面、传递窗、隔离器内表面等非产品接部位，其目标通常是对微生物负载实现6个对数的削减（从10⁶降至10⁰），将生物负载削减至可接受的工艺水平，但并不要求达到灭菌级别的绝对保证。

如果说得直接些，经过VHP处理后的隔离器内部环境，只是要求其微生物学质量“远优于任何依赖人工擦拭净化的环境”——这是目前VHP技术的真正价值所在，而非追求一个不可能实现的“灭菌”状态。

这就意味着对生物指示剂阳性结果的容忍度和处理方式，其风险参照系与灭菌工艺有着本质不同。

MPN的应用

再来审视MPN法在汽化过氧化氢净化验证中的应用。在BI某知名供应商的白皮书里简述了MPN计算的逻辑。

1.在日常验证中常规使用单点位三个BI，注意不是等出现阳性后再用三个BI做调查。这种做法是作为应对“不可避免”的“Rogue”阳性的预备措施，而并不是调查手段。

2.使用Halvorson-Ziegler方程，当出现1阳2阴时，使用该方程计算MPN（幸存孢子最可几数），进而计算孢子对数削减值（SLR）

Halvorson-Ziegler方程：、其中：

• n = 每个位置重复BI的数量（本例为3）
• r = 阴性BI的数量（本例为2）
• 
  

计算过程：MPN = ln(3/2) = ln(1.5) = 0.405

解释：这一数值表示，在该位置上，平均每只BI幸存0.405个孢子。

SLR（孢子对数削减值）计算：

其中：N₀ = BI的初始孢子数（证书标称值，本例为1.6 × 10⁶）

计算过程：

• log₁₀(1.6 × 10⁶) = 6.204
• log₁₀(0.405) = -0.393
• SLR = 6.204-(-0.393) = 6.597

结论：即使出现1阳2阴，通过MPN计算，仍然可以证明该位置达到了 6+孢子对数削减，因此循环可以通过验证。

对MPN方法的批判性审视

MPN法在汽化过氧化氢净化验证中应用的核心操作——将一个阳性生物指示剂在代数上赋值为“1”参与杀灭对数值的计算——实质上构成了一种保守性最弱（least conservative）的估计，而非最坏情况假设。这一赋值行为的有效性依赖于两个关键前提：其一，整个灭活过程遵循对数线性动力学，从而能够推导出一个恒定的D值；其二，幸存微生物在不同生物指示剂之间呈随机、独立的泊松分布。

但恰恰这两点存在假设不成立的潜在风险。

首先，使用MPN来解释异常结果的基本假设是存在对数线性杀灭曲线（并由此推断出一致的D值），尽管许多从业者都提出了这一假设，然而行业里很多所谓“气相”H₂O₂过程实际是“气+液”的双相过程，大量证据表明冷凝相的存在、局部浓度梯度、表面能差异和温度不均匀性等因素共同导致灭活曲线极可能呈现非线性特征，因此使用源自对数线性动力学的概念就存在假设条件失效的风险。

其次，Halvorson-Ziegler方程的MPN计算同样依赖于泊松分布假设——即幸存微生物在重复样品中呈随机分布。这一假设在固体载体BI中是否成立，从未被实验证实。如果双相系统中出现非线性杀灭，那么幸存孢子在不同生物指示剂之间的分布很有可能不再是随机的，而是呈现聚集性。

因此，一个阳性单位在代数上被简化为“1”参与杀灭对数值的计算，这种“阳性=1”的赋值实质上构成了一种保守性最弱（least conservative）的估计，而非最坏情况假设。就可能会导致幸存孢子在BI之间的分布存在聚集性，那么在一个未被灭活的生物指示剂中，实际幸存孢子数可能是1个，也可能是10个、100个乃至1×10⁶个，则MPN计算将严重低估幸存数。 

MPN法的应用价值

MPN法作为一种微生物学统计工具，本身具有坚实的方法学基础。它最初由微生物学家为水质检测而开发，用于对液体样品中均匀分散、浓度极低的微生物进行稀释梯度统计估算，其在低浓度微生物定量中的有效性已经过数十年实践验证。

正因为MPN法在原有场景中表现出的可靠性，当汽化过氧化氢净化验证中出现反复的、难以解释的“反常”阳性时，Sigwarth和Mouitandat等研究者尝试将其引入作为辅助判断工具，其初衷并非“造假”，而是在缺乏更好的定量手段时，提供一种有限度的、可重复的统计参照方法。这一出发点在实践层面是可以理解的——面对工艺过程固有的非均匀性和生物指示剂自身批次间变异叠加产生的干扰信号，验证人员需要一个可操作的决策框架，而非只能在“合格”与“不合格”之间作非此即彼的极端选择。

因此，将其MPN方法迁移至VHP净化验证后，其价值发生了根本性转变：从"定量估算工具"降级为"有限度的辅助放行参考"。

毕竟，在行业实践中，BI供应商不会否认，即使是最高质量的接种不锈钢载体，也有约0.3%的固有失败率——“Rogue”是必须学会共存的现实。

MPN法在VHP净化验证中的价值，不在于它能够"证明"工艺合格，而在于它能够在所有其他证据（物理、化学、历史数据）均指向工艺稳定的前提下，为处理偶发的、孤立的BI阳性提供一个有统计学参考依据的、操作上可行的处置路径。

在这一限定语境下，MPN法的价值主要体现在三个方面：其一，避免因孤立异常导致的全批次浪费——当数百个BI中仅出现1-2个孤立阳性时，MPN提供了介于"全盘接受"与"全盘拒绝"之间的中间选项；其二，提供超越阴阳二分法的灰度判断维度——将"阳性"细化为"统计上可接受的阳性"；其三，引导验证工作聚焦于关键位置——三个BI策略促使验证团队进行风险评估，识别最难净化的位置并集中监测。

然而，这些价值的实现必须严格遵守以下边界条件：可视作适用于净化工艺（目标6个对数削减）；必须有充分的物理监测和化学指示剂数据作为支撑；阳性必须为孤立、随机、不可复现事件，无空间聚集性；必须配套完整的后置跟踪计划，对阳性事件的根本原因调查。

当上述条件全部满足时，MPN法可被理解为一种"偶发异常的有条件处置工具"，其价值在于避免过度拒收，而非证明工艺合格。

综上，MPN法在汽化过氧化氢净化验证中的应用，应当被视为一把有条件的手术刀，而非万能的橡皮擦。Pflug博士那句“微生物不会说谎”的警言依然有效——它的正确解读不应是“BI永远正确”，而是“当BI说‘不’时，工程师有责任去倾听‘不’背后的物理现实”。MPN法可以作为倾听过程中的一个辅助工具，但它绝不应成为让设备操作员、验证工程师和质量管理人员提前停止倾听的理由。

作者：Shengyi 

来源：拾西

公众号日期：2026年7月8日